只因不小心被一只受过放射性感染的蜘蛛咬伤，平凡瘦弱的高中生彼得·本杰明·帕克（尼尔·帕特里克·哈里斯 Neil Patrick Harris 饰）的人生便发生了翻天覆地的变化。从此以后，他穿上红蓝相间的紧身服，戴上面具，凭借发射出的蜘蛛丝穿梭在喧哗闹市的每一个角落。“能力越大，责任越大”，彼得以蜘蛛侠的身份，和破坏城市及世界和平的恶势力作斗争。全新的征程，更强大的敌人，女武士鹿田、The Talon、电王（Ethan Embry 配音）、蜥蜴人（罗布·赞比 Rob Zombie 配音）、银貂（Virginia Madsen 配音）等可怕对手相继登场。蜘蛛侠从不退却，勇敢地迎上前去……

彼得·帕克践行班叔叔的格言，“能力越强，伴随的责任越大”，从此成为了行侠仗义的蜘蛛侠。他与蜘蛛小队成员迈尔斯、格温与安雅互相通力合作，在与劲敌的战斗中一次次克服艰难险阻，最终战胜了敌人。彼得在这个过程中更加理解责任与能力，获得惊人的成长，并逐渐提升蜘蛛侠的装甲和力量。

在彼得·帕克获得超能力并成为蜘蛛侠一年后，神盾局局长尼克·弗瑞找到他，邀请他参加训练，加入神盾局。彼得在学校里遇到了一同训练的四位小伙伴。他们表面上是高中同班同学，平日里一起上课学习，但是纽约街头一有危机出现，他们就立刻换上装备，化身超级英雄。在蜘蛛侠不断成长的过程中，各路反派总是为蜘蛛侠设下重重障碍，章鱼博士和毒液一次次卷土重来，甚至几度把蜘蛛侠和伙伴们置于险境。在一次战斗之后，他们原本的直升机被损毁，四位小伙伴只能暂时同彼得一起住进梅姨的家中。而且因为他们的身份特殊，蜘蛛侠和伙伴们需要对外隐瞒自己的超能力，为此彼得还受到了不少来自梅姨的误解，也常常给原本平静温馨的家庭生活带来一些麻烦。不过，几位肩负着保护纽约重任的少年们，总能在关键时刻打好配合，摆平一次又一次危机。

神盾局局长力克福尔给了彼得·派克一个训练的机会，让他成为终极蜘蛛侠，并与其他四个少年超级英雄力王、飞虎、冲击和铁拳联手一起训练。彼得·派克却忽视了他的队友，他和飞虎必须把他们的分歧放在一边，齐心协力处理危机隐藏自己的身份。彼得·派克经历了成长，不仅学会了懂得了团队意识和合作的重要性，也对自己的命运拥有了更好的理解与安排。